I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Mikroorganisme atau mikroba
adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya
diperlukan alat bantuan.Mikroorganisme disebut juga organisme
mikroskopik.Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler) maupun bersel banyak (multiseluler).Setiap mikroba
juga melakukan aktivitas seperti makhluk hidup lainnya
Aktivitas mikroba
diartikan sebagai kegiatan yang berkaitan dengan pertumbuhan,
perkembanganbiakan dan pembentukan sel-sel baru. Semua aktivitas sel tersebut
dilakukan oleh berbagai enzim yang terdapat dalam sel mikroba. Untuk
berlangsungnya aktivitas tersebut, sel mikroba akan menggunakan
komponen-komponen dalam lingkungannya (substrat/medium) sebagai sumber
energinya.
Mikroba memiliki berbagai aktivitas biokimia
(pertumbuhan dan perbanyakan) dengan menggunakan raw material (nutrisi)
yang diperoleh dari lingkungan sekitarnya. Transformasi biokimia dapat timbul
didalam dan diluar dari bakteri yang diatur oleh katalis biologis yang dikenal
sebagai enzim. Setiap mikroba memiliki kemampuan dalam menggunakan enzim yang
dimilikinya untuk degradasi karbohidrat, lemak, protein, dan asam amino.
Metabolisme atau penggunaan dari molekul organik ini biasanya menghasilkan
produk yang dapat digunakan untuk identifikasi dan karakterisasi mikroba.
Pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme
mikroorganisme yang diketahui dari kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan
dan menguraikan molekul yang kompleks seperti karbohidrat, lemak, protein dan
asam nukleat. Selain itu dilakukan pula pengamatan pada molekul-molekul
sederhana seperti asam amino dan monosakarida. Masing-masing mikroba berbeda
dalam kemampuannya menggunakan karbohidrat dan dalam cara pemecahan
karbohidrat. Hasil akhir pemecahan karbohidrat dapat dilihat melalui berbagai
pereaksi. Terbenuknya asam dapat diketahui dengan terjadinya perubahan pH
medium, hal ini dapat diketahui dengan menambahkan indicator pada medium
sebelum dilakukan inokulasi, sedang dihasilkannya gas dapat ditampung menggunakan
tabung Durham.Seperti juga pemecahan pada makromolekul misalnya pati dan enzim
amylase dapat diketahui dengan menambahkan larutan yod pada akhir inkubasi.
Sedangkan untuk pengujian hidrolisis protein biasanya digunakan medium skim milk agar, jika disekitar koloni
tampak jernih berarti terjadi hidrolisis pada protein
Metabolisme
seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi
mikroorganisme. Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan
mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti
zat pati, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu pengamatan juga dilakukan
pada molekul yang sederhana seperti amino dan monosakarida(Dwijoeseputro, 2004).Oleh
karena itu pada praktikum ini akan melihat aktivitas mikroba dari hasil samping
metabolisme yang dihasilkannya dengan beberapa peraksi, yaitu bromo thymol blue untuk uji mono &
disakarida dan larutan yod untuk uji hidrolisis pati dan protein
B. Tujuan
Mempelajari aktivitas mikroba dalam pemecahan
mono dan disakarida, polisakarida (pati) serta polipeptida (protein)
II.
TINJAUAN
PUSTAKA
Mikroorganisme seperti juga makhluk
hidup yang lainnya, memerlukan energi untuk kelangsungan hidupnya.
Energi ini diperoleh dari lingkungan sekitarnya dalam bentuk senyawa kimia
tertentu yang diurai melalui reaksi biokimia semu yang disebut reaksi
metabolisme (Ristiati, 2000). Reaksi metabolisme merupakan semua
reaksi kimia yang terjadi dalam organisme hidup untuk memperoleh dan
menggunakan energi sehingga organisme dapat melaksanakan berbagai fungsi
hidupnya. Aktivitas metabolisme dilaksanakan oleh enzim-enzim, yaitu
suatu biokatalisator yang dapat mengkatalis reaksi kimia di dalam sel.
Metabolisme juga berarti seretentan reaksi kimia yang terjadi di dalam sel
hidup. (Waluyo, 2004).
Beberapa mikroorganisme diketahui
mempunyai enzim yang berguna untuk memecah senyawa-senyawa komplek
polisakarida. Enzim-enzim ini merupakan enzim ekstra seluler yang memecah
senyawa dengan hidrolisa. Karbohidrase adalah enzim yang menghidrolisa
polisakarida menjadi maltose dan glukosa, hasil hidrolisa dapat dideteksi
dengan menggunakan lugol. Fermentasi karbohidrat yang terjadi secara aerob
dan anaerob merupakan aktivitas lanjutan reaksi enzimatis, terhadap glukosa
menjadi asam organik, alkohol atau gas CO2
Karbohidrat
merupakan sumber energy utama bagi kebanyakan mikroba. Masing-masing mikroba
berbeda dalam kemampuananya menggunakan berbagai karbohidrat dan dalam cara
memecah karbohidrat. Pemecahan karbohidrat (misalnya pati) menghasilkan mono- dan
disakarida. Monosakarida adalah karbohidrat yang paling sederhana, yaitu
karbohidrat yang tidak dapat diuraikan atau dihidrolisis menjadi karbohidrat
yang lain. Macam monosakarida yaitu glukosa, galaktosa, dan fruktosa.
Disakarida merupakan dimer monosakarida yang sejenis atau berbeda jenis,
sehingga bila dihidrolisis akan menghasilkan 2 monosakarida.
Karbohidrat
merupakan substrat utama yang dipecah dalam proses fermentasi. Polisakarida
akan dipecah terlebih dahulu menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana,
misalnya hidrolisis pati menjadi unit-unit glukosa. Glukosa kemudian akan
dipecah menjadi senyawa-senyawa lain tergantung jenis fermentasinya. Hasil
fermentasi glukosa dapat berupa asam atau gas. Gas yang dihasilkan dapat
dideteksi dengan menggunakan tabung durham. Gas-gas yang dihasilkan sebagai
hasil pembongkaran dapat berupa karbondioksida, hydrogen, hydrogen sulfide dan
lain-lain. Asam yang timbul akibat kegiatan bakteri dapat berupa asam organic
maupun asam anorganik.
Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan
produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi
mikroorganisme. Hasil akhir dari fermentasi karbohidrat ini ditentukan oleh
sifat mikroba, media biakan yang digunakan, serta factor lingkungan antara lain
pH dan suhu. Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasi
dan difermentasikan oleh mikroorganisme. Glukosa merupakan senyawa yang paling
sering digunakan oleh mikroorganisme dalam proses fermentasi itu. Selain itu terdapat
pula media sukrosa dan laktosa.Beberapa mikroorganisme seperti E. coli, dapat
menggunakan laktosa sebagai sumber karbon.
Bakteri Escherichia coli memiliki bentuk batang dan tergolong dalam
bakteri Gram negatif. Escherichia coli tumbuh pada suhu optimum 370C dan
pada kisaran suhu 100C – 400C. Nilai pH optimum pertumbuhannya 7,0 – 7,5.
Bakteri ini memiliki ukuran panjang 2,0 – 6,0 mikron, sering terdapat dalam
bentuk tunggal atau berpasangan, bersifat motil atau non motil dengan flagella
peritrikat, bersifat anarobik fakultatif, dan tergolong dalam famili Enterobactericeae
.
Escherichia coli merupakan pengkatalisa karbohidrat dengan formasi
asam dan gas. Escherichia coli termasuk mikroorganisme tidak
menguntungkan pada keadaan normal. Escherichia coli disebut juga
koliform fekal karena ditemukan dalam saluran usus hewan dan manusia. Selain
itu E. coli juga sering dijadikan indikator kontaminasi kotoran.
Bacillus subtilis
termasuk jenis Bacillus. Bacillus sp merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, dapat
tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Bacillus secara alami
terdapat dimana-mana, dan termasuk spesies yang hidup bebas atau bersifat
patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim ekstraseluler
seperti protease, lipase, amilase, dan selulase yang
bisa membantu pencernaan dalam tubuh hewan (Wongsa dan Werukhamkul, 2007).
Jenis Bacillus (B. cereus, B. clausii dan B. pumilus)
termasuk dalam lima produk probiotik
komersil terdiri dari spora bakteri yang telah dikarakterisasi dan berpotensi
untuk kolonisasi, immunostimulasi, dan aktivitas antimikrobanya (Duc et al.,
2004).
Bacillus subtilis
mempunyai kemampuan untuk membentuk endospora yang protektif yang memberi
kemampuan bakteri tersebut mentolerir keadaan yang ekstrim. B. subtilis
tidak dianggap sebagai manusia pathogen walaupun dapat mencemari makanan tetapi
jarang menyebabkan keracunan makanan. B. subtilis menghasilkan enzim
proteolytic yang subtilisin. Spora B. subtilis dapat hidup yang ekstrim
pemanasan yang sering digunakan untuk memasak makanan, dan bertanggung jawab
untuk menyebabkan kekentalan yang lengket. Beberapa keunggulan dari bakteri ini
adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel.
Pada prinsipnya pengamatan aktivitas
biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang diketahui dari kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks dan molekul-molekul sederhana. Selain itu, metabolisme
seringkali menghasilkan hasil sampingan
yang dapat digunakan untuk identifikasi (Harmita, 2008).
Di dalam proses
metabolisme ada zat-zat yang masuk dan ada pula zat-zat yang dibongkar dan
kemudian dikeluarkan sisanya. Zat yang disusun atau dihasilkan dalam pnguraian
tersebut disebut metabolit. Bakteri memiliki zat-zat tertentu, baik untuk
mengambil zat-zat makanan maupun untuk membongkarnya. Zat-zat itu secara umum
disebut sekret; enzim-enzim terutama dari golongan hidrolase merupakan sekret
yang banyak dihasilkan bakteri.
III.
METODE PRAKTIKUM
A.
Alat
dan Bahan
Alat:
1. cawan
petri steril
2. jarum
ose
3. lampu
spirtus
4. tabung
reaksi
5. tabung
durham
6. bunsen
Bahan:
1. Medium
air yang mengandung glukosa,
fruktosa,sukrosa, dan laktosa serta indicator bromo tymol blue
2. Medium
padat :medium agar pati dan skim milk
agar, larutan yod
3. Kultur
murni Bacillus subtilis dan E.coli
B.
Prosedur
Kerja
1.
Uji
pemecahan mono dan disakarida
2.
Uji
hidrolisis pati
3.
Uji
hidrolisis protein
IV.
HASIL
DAN PEMBAHASAN
Dari kegiatan praktikum
yang telah dilaksanakan yaitu mengenai aktivitas mikroba dalam pemecahan mono
dan disakarida, polisakarida (pati) serta polipeptida (protein), hasil
pengamatan mengenai adanya aktivitas mikroba pada pemecahan mono dan disakarida
dapat dilihat pada table.1 dan table.2 sedangkan untuk hasil uji hidrolisis pati dan
protein terhadap aktivitas mikroba dapat dilihat dari gambar dibawah .
1. Uji pemecahan mono dan disakarida
Tabel.1 uji pemecahan mono dan disakarida oleh bakteri
Eschericia coli
Medium
|
Warna
|
Gelembung
|
Foto
|
Glukosa
|
Biru kekuningan
|
Ada
|
|
Fruktosa
|
Kuning pekat
|
Tidak ada
|
|
Sukrosa
|
Kuning pekat
|
Ada
|
|
Laktosa
|
Kuning cerah
|
Ada
|
|
Tabel.2 uji pemecahan mono dan disakarida oleh bakteri
Bacillus subtilis
Medium
|
Warna
|
Gelembung
|
Foto
|
Glukosa
|
Berubah warna menjadi hijau
|
Tidak ada gelembung
|
|
Fruktosa
|
Kuning (tidak berubah)
|
Tidak ada gelembung
|
|
Sukrosa
|
Berubah warna menjadi hijau
|
Tidak ada gelembung
|
|
Laktosa
|
Kuning (tidak berubah)
|
Tidak ada gelembung
|
|
Setiap makhluk hidup
yang melakukan metabolisme pasti akan menghasilkan metabolit, yaitu zat yang
disusun atau dihasilkan pada saat penguraian tersebut. Begitu pula dengan
bakteri, yang menghasilkan metabolit saat melakukan aktivitas. Untuk mengetahui
aktivitas bakteri tersebut dilakukan uji pembentukan asam dan gas dengan
menggunakan tabung Smith atau tabung Durham.
Pada praktikun ini akan
membahas mengenai aktivitas mikroba pada pemecahan mono dan disakarida.
Monosakarida yang digunakan adalah glukosa dan fruktosa sedangkan disakarida
yang digunakan adalah sukrosa dan laktosa. Uji pemecahan mono dan
disakarida dilakukan dengan
menginokulasikan bakteri ke dalam tabung reaksi berisi larutan glukosa,
sukrosa, fruktosa, dan laktosa yang mengandung indikator Bromothimol Blue dan
didalamnya terdapat tabung Durham. Indikator tersebut digunakan untuk
mengetahui pembentukan asam. Bakteri yang digunakan pada praktikum ini adalah Bacillus
subtilis dan E. Coli.
Hasil pengamatan yang
diperoleh dari praktikum yaitu pada tabung reaksi yang berisi larutan glukosa,
sukrosa, dan laktosa yang ditumbuhkan E. Coli terdapat gelembung di
sekitar tabung, hal ini menandakan bahwa di dalam tabung tersebut bakteri
melakukan aktivitas atau metabolisme yang menghasilkan gas yang dibuktikan
dengan adanya gelembung yang ada pada tabung. Sedangkan pada tabung reaksi yang
berisi larutan fruktosa tidak ada gelembung. Hal ini berbeda dengan tabung
reaksi berisi larutan glukosa, fruktosa, sukrosa dan laktosa yang ditumbuhkan B. subtilis yang
tidak terdapat gelembung. Hasil pengamatan ini menunjukkan bahwa terdapat
aktivitas bakteri E.coli pada larutan
glukosa, sukrosa dan laktosa.
Selain adanya gelembung, aktivitas bakteri dapat
ditandai dengan adanya perubahan warna. Perubahan warna medium mejadi kuning
disebabkan karena terdapatnya indicator brom timol blue (BTB) dalam medium.
Dimana penambahan indicator BTB ke dalam medium yang mengalami fermentasi
karbohidrat jadi asam dalam keadaan aerob, maka pH akan turun dan akhirnya
indikator BTB ini akan berubah warna menjadi kuning. Larutan yang telah diberi
indikator BTB akan menghasilkan warna biru, yang kemudian warna ini akan
berubah bila ada aktivitas dari mikroorganisme.
Hasil pengamatan yang diperoleh yaitu, pada tabung
reaksi berisi larutan fruktosa dan sukrosa yang ditumbuhkan bakteri E. coli warnanya kuning pekat, pada larutan laktosa warnanya kuning cerah dan
pada larutan glukosa warnanya biru kekuningan. Sedangkan pada tabung
reaksi yang berisi larutan fruktosa dan laktosa yang ditumbuhkan bakteri B.
subtilis warnanya kuning, pada larutan sukrosa pada glukosa warnanya
berubah menjadi hijau. Hasil pengamatan ini menunjukkan bahwa terdapat aktivitas bakteri E.coli pada larutan fruktosa, sukrosa,
dan laktosan. Sedangkan aktivitas bakteri B.subtilis
terlihat pada larutan fruktosa dan laktosa.
2. Uji
hidrolisis pati
Bacillus
substilis
Zona
bening Eschericia coli
Pati didegradasi oleh
enzim amilolitik dari sejumlah mikroorganisme.
α amilase adalah salah satu enzim yang paling penting dan banyak
digunakan dalam bioteknologi sekarang ini. Amilase merupakan enzim yang
menghidrolisis molekul pati untuk memberikan produk yang bervariasi termasuk
dekstrin dan polimer-polimer kecil yang tersusun dari unit-unit glukosa. Spektrum
pemakaian enzim almilase secara luas digunakan di berbagai bidang seperti
medis, kimia analisis, industry tekstil industry makanan dan industry penyulingan
(Pandey et al,2000)
Pemecahan pati dapat
diketahui dengan menambahkan larutan yod pada akhir inkubasi. Jika berwarna
biru disekitar koloni berarti pati belum terhidrolisis oleh enzim, tetapi
apabila disekitar koloni Nampak zona jernih dan tidak berwarna maka mikroba
telah menghodrolisis pati dengan enzim amylase. Isolat bakteri yang
mengindikasikan penghasil enzim amylase dilihat aktivitasnya dengan mengukur
diameter zona bening disekitar isolate bakteri. Zona bening yang terbentuk
disekitar isolate bakteri menunjukkan bahwa isolate bakteri tersebut mampu
menghidrolisis pati (Dirnawan et al,2000). Besar kecilnya diameter zona bening
yang terbentuk dari masing-masing isolate berbeda-beda. Hal ini disebabkan
kemampuan menghidrolisis pati dari setiap isolate juga berbeda-beda. Pada
praktikum ini dihasilkan zona bening diantara kedua bakteri. Hal tersebut
menunjukkan adanya hidrolisis pati oleh bakteri.
3.
Uji
hidrolisis protein
Zona Bening
Bacillus substilis
Eschericia coli
Protein berasal dari kata Yunani Proteios yang
artinya “pertama”. Protein adalah poliamida dan hidrolisis protein
menghasilkan asam- asam amino. Bakteri melakukan hidrolisis berbagai
protein menjadi asam amino tunggal dengan tujuan menggunakan asam amino
tersebut untuk sintesis protein dan molekul seluler yang lain atau sebagai
sumber energi (Kaiser, 2005).
Metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya
aktivitas bakteri proteolitik adalah dengan menggunakan medium yang mengandung
kasein yaitu Skim Milk Agar. Kasein adalah salah satu jenis protein. Hidrolisis
kasein digunakan untuk memperlihatkan aktivitas hidrolitik protease yang
memutuskan ikatan peptida CO-NH. Hidrolisis protein ditunjukkan dengan adanya
zona bening di sekeliling pertumbuhan bakteri (Susanti, 2003). Pengujian secara
kualitatif dilakukan dengan cara mengamati zona bening yang berada di sekitar
koloni bakteri, kemudian membagi diameter zona bening dengan diameter koloni
bakteri. Hasil bagi diameter tersebut dinyatakan sebagai aktifitas protease
secara relatif .Pada praktikum uji
hidrolisis protein ini terlihat bahwa
bakteri B.subtilis dan E.coli mampu menghidrolisis protein yang
ditandai terbentuknya zona bening yaitu daerah yang terhidrolisis pada bagian
cawan petri. Aktivitas tersebut dapat berlangsung karena kedua mikroba tersebut
mampu memproduksi enzim protease untuk mengkatalisis protein yang terdapat pada medium susu skim
agar yang mempuyai kandungan protein tinggi
V.
PENUTUP
A. Simpulan
Dari praktikum ini
dapat ditarik kesimpulan bahwa pada bakteri E.coli
dan B.subtilis tidak memecah semua
jenis mono dan disakarida, hal ini terlihat dengan tidak semua jenis larutan mono
dan disakarida yang diuji memperlihatkan
adanya aktivitas mikroba yang ditandai dengan adanya gelembung dan perubahan
warna setelah ditambah bromo tymol blue. Tetapi kedua bakteri itu dapat
menghidrolisis pati dan protein, hal ini telihat terbentuknya zona bening pada
medium pati dan susu skim agar. Kedua bakteri dapat menghidrolisis pati karena adanya enzim amilase yang dimiliki oleh
bakteri sedangkan pada protein dapat dihidrolisis karena kedua bakteri
tersebut mampu memproduksi enzim protease untuk mengkatalisis protein
B. Saran
Pada praktikum diharapkan
lebih hati-hati lagi dalam mengambil mikroba yang digunakan untuk pengujian
sehingga agar yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba tidak terambil dan juga
lebih berhati-hati dalam menuangkan media agar, supaya hasilnya bisa lebih
mudah diamati
DAFTAR
PUSTAKA
Dirnawan, et
al.2000.Eksplorasi bakteri termofil
penghasil enzim hidrolitik ekstraseluler dari sumber air panas Gunung Pancar.Hayati
7: 52-55.
Duc LH, Hong HA,
Barbosa TM, Henriques AO, Cutting SM. 2004. Characterization of Bacillus probiotics
available for human use. J Appl Environ Microbiol 70(4): 2161–2171.
Dwijoeseputro. 2003. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Harmita, dkk.
2008. Buku Ajar Analisis Hayati. Buku
Kedokteran EGC, Jakarta.
Kaiser C, Van der Merwe R, Bekker TF, Labuschagne.
2005. In-vitro inhibition of mycelial
growth of several phytopathogenic fungi, including Phytophthora cinnamomi by
soluble silicon. South African
Avocado Growers Association Yearbook. 28: 70-74.
Pandey, et
al.2000.Advances in microbial amylase.Biotechnol.Appl.Biochem
31:135-152.
Ristiati NP.
2000. Pengantar Mikrobiologi Umum. Proyek Pengembangan Guru sekolah Menengah
IBRD Loan No 3979, Jakarta.
Susanti,
V.H.2003. Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bacillus subtilis 1012M15.
Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Waluyo, Iud. 2004. Mikrobiologi Umum.
Universitas Muhammadiyah Malang, Malang.
Wongsa P,
Werukhamkul P. 2007. Product development
and technical service, biosolution international. Bangkadi Industrial Park 134/4, Thailand.